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發(fā)酵工藝中感染噬菌體的原因及如何殺滅噬菌體

更新時(shí)間:2023-11-23   點(diǎn)擊次數(shù):626次
01概述
噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、藻類 、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱,因部分能引起宿主菌的裂解,故稱為噬菌體。當(dāng)發(fā)酵液受到噬菌體嚴(yán)重污染時(shí),可能會(huì)對(duì)發(fā)酵過程產(chǎn)生不良影響,甚至導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵過程的失敗。因此,在發(fā)酵過程中,要采取有效的預(yù)防和控制措施,避免發(fā)酵液受到噬菌體污染。這包括加強(qiáng)發(fā)酵設(shè)備、原材料、水質(zhì)等方面的衛(wèi)生管理,以及定期進(jìn)行微生物學(xué)檢測和噬菌體檢測等。
02噬菌體的主要特性
1)專一的寄生性。噬菌體只能在專一的宿主細(xì)胞中生長繁殖,只能在活的、處于繁殖階段的細(xì)胞中生長繁殖,不能脫離宿主而自行生長繁殖。如果不同菌株的親緣關(guān)系比較近,那么此菌株也是會(huì)感染的,特別是針對(duì)長期生產(chǎn)同一產(chǎn)品的發(fā)酵工廠要特別注意,在換新菌株之前必須了解其背景。
2)不耐熱性。游離的噬菌體在45℃條件下10min就可使其失活。
3)不耐藥性。直接在噬菌體上噴灑1%新潔爾滅、75%酒精、1%雙氧水、5%的甲醛等都可使其失活。


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五種有尾噬菌體的基本結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)蛋白所在的部位
03噬菌體染菌的現(xiàn)象1)發(fā)酵周期延長,甚至產(chǎn)物生成量減少或停止;2)發(fā)酵(OD值)光密度不上升或回降;3)pH逐漸上升;4)氨利用停止;5)糖耗、溫升緩慢或停止;6)產(chǎn)生大量泡沫,發(fā)酵液呈黏膠狀;7)發(fā)酵液變清,鏡檢時(shí)菌體數(shù)量顯著減少,甚至找不到完整的菌體。


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典型的噬菌體感染周期
04噬菌體的檢查方法
1)樣品處理:將細(xì)菌樣品混合于緩沖液中,加入適量的噬菌體,混合均勻。將混合液在室溫下放置一段時(shí)間,使噬菌體充分感染細(xì)菌。
2)細(xì)菌培養(yǎng):將上述混合液涂布在合適的固體培養(yǎng)基上,于恒溫器中培養(yǎng)一段時(shí)間,使細(xì)菌生長并被噬菌體感染。3)噬菌斑檢測:觀察培養(yǎng)皿上的菌落,尋找由于噬菌體感染而形成的透明斑,即噬菌斑。用記號(hào)筆標(biāo)記噬菌斑的位置。4)定量檢測:可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法,對(duì)噬菌體進(jìn)行定量檢測。
5)宿主范圍檢測:將不同的細(xì)菌菌株與噬菌體共同培養(yǎng),觀察是否能形成噬菌斑。通過這種方式可以檢測噬菌體對(duì)不同細(xì)菌的感染能力,即宿主范圍。
6)生物學(xué)特性分析:對(duì)噬菌體的生物學(xué)特性進(jìn)行分析,如基因組大小、感染能力、復(fù)制周期等。這些特性可以反映噬菌體的種類和特點(diǎn),有助于對(duì)其進(jìn)行分類和研究。


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05怎么樣控制噬菌體對(duì)發(fā)酵的危害
5.1  感染噬菌體的原因
① 菌種本身帶噬菌體,特別是溶源性噬菌體,對(duì)這種菌種,一經(jīng)發(fā)現(xiàn),應(yīng)立即棄去② 發(fā)酵車間環(huán)境里噬菌體隨空氣進(jìn)入發(fā)酵罐污染。盡管發(fā)酵罐有空氣過濾器,但如果環(huán)境空氣存在噬菌體,空氣過濾器無法過濾攔截,從空氣過濾原理得知只能攔截一部分的噬菌體。③ 罐體、管道清洗消毒不到位,或時(shí)間久了存在管道頑固性生物膜給予的再次污染。
④ 車間管理的疏忽大意。認(rèn)為發(fā)酵只是發(fā)酵車間的事情與其他無關(guān),其實(shí)預(yù)防噬菌體必須人人參與,提高意識(shí),各部門配合且長期堅(jiān)持下去。
5.2  殺死噬菌體的方法1)物理方法:可以采取高溫滅菌、紫外線輻射、過濾等方法去除噬菌體。這些方法簡單易行,但也有其局限性,比如過濾方法只能去除噬菌體的一部分,而高溫滅菌和紫外線輻射對(duì)設(shè)備和物品也會(huì)造成一定的損害。2)化學(xué)方法:可以使用化學(xué)消毒劑去除噬菌體,例如過氧乙酸、氯氣等。這些化學(xué)消毒劑具有強(qiáng)烈的殺菌作用,可以去除大部分的噬菌體,但也需要注意消毒劑的濃度和使用方法,以避免對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和人員產(chǎn)生不利影響。3)生物方法:可以使用其他細(xì)菌或病毒對(duì)噬菌體進(jìn)行防治,例如利用具有廣譜殺菌作用的細(xì)菌或利用分子生物學(xué)技術(shù)針對(duì)特定的噬菌體進(jìn)行干預(yù)。這些方法相對(duì)于物理和化學(xué)方法而言更加精準(zhǔn)和有效,但也需要特定的技術(shù)和設(shè)備支持。5.3  預(yù)防噬菌體的措施
(1)五大誤區(qū)
① 精度為0.01um的空氣過濾器能阻攔噬菌體空氣。過濾器中的0.01um的精度不是單指膜的精度,他是把布朗運(yùn)動(dòng)、撞擊等攔截都計(jì)算在內(nèi)的,故0.01um只是個(gè)相對(duì)精度,實(shí)際上膜的絕對(duì)精度在0.2um左右,故0.01um的空氣過濾器可以擋住一部分噬菌體,但不能擋住。用過濾器的洗脫液經(jīng)電鏡觀察,可以看到噬菌體的存在。
② 噬菌體不耐熱,65℃以上的溫度可殺死噬菌體。我們所說的熱滅菌是指達(dá)到一定的溫度并維持一定的時(shí)間,使微生物致死的過程,可在實(shí)際生產(chǎn)中我們經(jīng)常會(huì)遇到溫度達(dá)到了使噬菌體致死的溫度,可是卻殺不死噬菌體,主要原因在于維持時(shí)間不夠。這就很容易解釋為什么空氣在進(jìn)罐前就已經(jīng)加熱到70C,可噬菌體仍然能活著進(jìn)罐。
③ 噬菌體對(duì)藥物敏感。甲醛等消毒劑可殺死噬菌體原理同上,雖然藥的濃度和劑量足夠,可是如果維持時(shí)間不夠仍起到不殺菌效果。用5%的甲醛對(duì)全廠區(qū)噴灑,而后在環(huán)境中取樣測定,仍有很多活噬菌體。
④ 預(yù)防噬菌體是發(fā)酵車間的事情,與其他車間無關(guān)。噬菌體的防治是要上下齊動(dòng)手,人人都參與。發(fā)酵要做好是需要各部門配合且長期堅(jiān)持下去。
⑤ 生產(chǎn)正常時(shí),對(duì)噬菌體的警惕可以放松一點(diǎn)了。對(duì)于噬菌體的防治,我們要做到時(shí)刻警惕。
(2)嚴(yán)格活菌排放放
由于噬菌體缺乏獨(dú)立代謝的酶體系,不能脫離寄生而自行生長繁殖,因而噬菌體的繁殖必須依存于寄生菌的繁殖,噬菌體只能在活的、正處于生長繁殖階段的細(xì)胞中進(jìn)行繁殖,而在死的、老的或休眠狀態(tài)的細(xì)胞中以及代謝產(chǎn)物上都不能繁殖。因此,如果我們能夠不讓活的生產(chǎn)菌在環(huán)境中生長蔓延,也就切斷了噬菌體的食物來源,破壞了噬菌體的滋生場地和繁殖條件。
① 每次上罐前對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行空氣試漏處理,防止由于設(shè)備原因造成活菌的外泄和噬菌體的進(jìn)入。
② 在接完種后,必須對(duì)殘余種子液、接種瓶、種子罐及其連接管道附件等用蒸汽或藥物消毒,沒經(jīng)過滅活處理的種子液不得排入污水池。
③ 在發(fā)酵過程中,需要知道細(xì)菌的生長情況,要求定時(shí)取樣對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測分析。取樣最好在無風(fēng)的條件下進(jìn)行,取樣口下方需設(shè)一個(gè)裝有堿液((pH≥11)的容器,除了加蓋取樣瓶中的料液外,其余料液必須全部進(jìn)入該堿容器,切勿噴灑或直接進(jìn)入下水道。取完樣后,要用消毒水對(duì)取樣者的手、取樣瓶、裝堿容器和以取樣品為中心的上下左右1m的空間進(jìn)行立體的噴灑;取樣瓶需裝在盛有消毒水的容器中直到化驗(yàn)室。
④ 化驗(yàn)室檢測的對(duì)象就是帶有活菌的料液,檢測完pH后的電極需先用新潔爾滅沖洗,沖洗水入pH≥11的堿桶中;測OD時(shí),移取原液的移液管或移液槍頭須入堿水浸泡,比色管、比色器皿用新潔爾滅清洗浸泡30min后才可繼續(xù)使用;離心管用新潔爾滅清洗浸泡30分鐘后才可繼續(xù)使用,且離心后固相及其清洗水須入堿桶中,凡是與料液有直接接觸的液體廢棄物須入堿桶,嚴(yán)禁直接排入下水池;凡是與料液有直接接觸的固體廢棄物須有pH≥11堿水浸泡2h后方可廢棄。
⑤ 在發(fā)酵罐運(yùn)行過程中有大量的尾氣要外排,而這尾氣中就含有活菌體,故尾氣需經(jīng)過處理并且要排到遠(yuǎn)離車間100m以上的車間下風(fēng)口位置。
(3)環(huán)境衛(wèi)生,消滅噬菌體與雜菌
① 加強(qiáng)環(huán)境消毒:車間內(nèi)部用漂白水和新潔爾滅輪流對(duì)所有地面角落進(jìn)行噴灑,定點(diǎn)放置固體二氧化氯,使車間內(nèi)部能聞到淡淡的藥味。每天早晚一次對(duì)車間地溝用漂白粉消毒,保持地溝內(nèi)清潔無積水。車間周圍用二氧化氯、漂白粉每天噴灑2次。
② 加強(qiáng)普查力度:定期(3天1次) 對(duì)車間內(nèi)部和車間周圍環(huán)境中的雜菌含量進(jìn)行普查統(tǒng)計(jì),重點(diǎn)部位要求每天普查,對(duì)測得不合格的區(qū)域進(jìn)行重點(diǎn)消毒,并且分析雜菌的來源。定期檢測噬菌體案例與檢測空氣中噬菌體的方法。
③ 車間四周、角落及樓周圍不要亂堆東西,要保持整齊、清潔,定期清掃、沖刷,撒漂白粉或石灰等。
④ 加強(qiáng)對(duì)蛇管的檢查力度。特別是彎頭和焊接部分,極易受到料液的腐蝕而穿孔。蛇管中循環(huán)水的壓力一般大于罐內(nèi)壓力,不管穿孔多少,水中的噬菌體會(huì)源源不斷的進(jìn)入發(fā)酵罐中,需特別引起重視。


發(fā)酵罐噬菌體污染如何解決


(4)嚴(yán)防噬菌體進(jìn)入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi)
a.種子
1)使用本身帶有噬菌體的菌種。
2)種子室與發(fā)酵車間分開、遠(yuǎn)離,使種子工作不處于有噬菌體和雜菌污染的環(huán)境中,以確保種子進(jìn)行的第一環(huán)不染噬菌體。
3)加強(qiáng)噬菌體檢測工作。定期檢測環(huán)境中噬菌體,掌握噬菌體情況。
b.嚴(yán)格無菌操作
① 加強(qiáng)種子室滅菌、無菌操作及安全衛(wèi)生措施。感染噬菌體的培養(yǎng)物不得帶入無菌室、搖瓶間(因噬菌體可透過紗布棉塞飛揚(yáng)),種子室應(yīng)盡量減少與外界接觸。
② 二級(jí)種子接種時(shí)停風(fēng)扇關(guān)門窗,用焰火封閉。
③ 消滅設(shè)備死角。定期檢查設(shè)備,尤其是種子罐,罐頂、擋板、冷卻管、罐底.攪拌器、罐壁與節(jié)門等處、滲漏及結(jié)垢,及時(shí)解決。設(shè)備要易于清洗與維修。管路要簡化,閥門要可靠。
④ 認(rèn)真進(jìn)行培養(yǎng)液、發(fā)酵設(shè)備、空氣凈化系統(tǒng)及管路的消毒工作。
c.凈化空氣
在發(fā)酵中,因?yàn)樾枰罅客ㄈ肟諝?,所以必須高度注意由空氣而來的污染。噬菌體在干燥狀態(tài)比濕潤狀態(tài)穩(wěn)定,從空氣中分離到的耐干燥的噬菌體,能長時(shí)間存活而浮游于空氣中,是造成噬菌體污染的重要原因,要特別重視。


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(5)感染噬菌體后的發(fā)酵罐及其相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)處理
1)發(fā)酵罐要經(jīng)過空消121℃,30min→5%甲醛100°C,4h→4%堿水100°C,4h→空消121℃,30min處理;2)所有與罐體直接相連的閥門拆下來肢解后用4%堿水浸泡4h,然后組裝好試壓 (0.8MPa的壓縮空氣)不漏后待用。3)物料管道用5%甲醛熏蒸4h,然后用4%熱堿水浸泡30min以上,用清水清洗干凈備用。4)移種管道用5%甲醛熏蒸4h,煮罐后的堿水通過移種管道排出,再用蒸汽消毒1h,要求每個(gè)排污閥都要微開,確保有水或汽排出。
5)把補(bǔ)料罐先清空,補(bǔ)料管道用5%甲醛熏蒸4h,煮罐后的堿水通過移種管道排出,再用蒸汽消毒1h,要求每個(gè)排污閥都要微開,確保有水或汽排出。
6)放料管道用5%甲醛熏蒸4h,煮罐后的堿水通過放料管道排出,再用蒸汽消毒1h。
7)空氣總管用5%甲醛熏蒸4h,要求每個(gè)支路都要消到,再用蒸汽沖刷3h,最后用空氣吹干。
8)配料槽儲(chǔ)料槽等用4%熱堿水浸泡4h。
9)取樣瓶等用消毒水或堿水浸泡。
10)空氣過濾器重消吹干后備用。
奧克泰士在發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域的作用和優(yōu)勢:
1)廣譜型殺菌,一種產(chǎn)品就能全面殺滅細(xì)菌、真菌等,包括芽孢、噬菌體、耐熱菌、霉菌、雜菌等各種類型微生物。
2)有效應(yīng)對(duì)高抗性微生物污染,高數(shù)量等級(jí)微生物污染。
3)多用途,適用于發(fā)酵車間環(huán)境、管道、發(fā)酵罐、水處理系統(tǒng)等等各環(huán)節(jié)的消毒殺菌工作。
4)食品級(jí)生態(tài)型,產(chǎn)品性狀為無色無味的透明液體,作用完畢后分解為水和氧氣。
5)良好的材料兼容性,基本無腐蝕,保護(hù)設(shè)備材料。
6)來自德國,提供德國和歐盟先進(jìn)的微生物控制理念。
7)相關(guān)案例支持,擁有豐富的微生物處理經(jīng)驗(yàn)。8)根據(jù)現(xiàn)場具體的微生物狀況,提供科學(xué)針對(duì)性的解決方案。


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